論文已發(fā)表在《發(fā)酵科技通訊》2022年4期

論單通道檢測在發(fā)酵尾氣分析中的應用

              公維麗1，2，劉仲匯1，2，馬耀宏1，2，史建國1，2
        (1．齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)  生物研究所，山東 濟南 250014；

2．山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014)

摘要：發(fā)酵尾氣分析技術在業(yè)內(nèi)的應用已逐漸展開，但人們對單通道檢測的認識依舊模糊 。從尾氣分析的意義、生物過程的“實時性”以及發(fā)酵過程的“臨界點”反映發(fā)酵狀態(tài)的改變等方面，闡述了發(fā) 酵尾氣分析應采用實時、連續(xù)、在線檢測；通過以尾氣分析獲得的“臨界點”在發(fā)酵工程中的應用(指 導轉速調(diào)整、流加補料、乳糖誘導及處理異常發(fā)酵)，進一步闡明只有單通道檢測才能真正做到檢測 的實時、連續(xù)、在線，捕捉到有價值的“臨界點”信息。
關鍵詞：發(fā)酵；尾氣分析；單通道；檢測
中圖分類號：Q819                   文獻標志碼：A                        文章編號：1674－2214(2022)04－0217－05 DOI:10. 16774/j.cnki.issn. 1674-2214.2022.04.009
Discussion on the application ofsingle channel detection in fermentation tail gas analysis
GONG Weili1，2，  LIU Zhonghui1，2，  MA Yaohong1，2，  SHI Jianguo1，2
        (1．Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)，  Biology Institute，Jinan 250014，  China；
2．Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors，Jinan 250014，  China)

Abstract：  The  technology  of  fermentation  tail  gas  analysis  has  been  gradually  developed  and applied in the industry，  but single－channel detection is still poorly understood．  In this paper， we expounded that fermentation tail gas analysis should adopt real－time continuous online detection         from the significance of fermentation tail gas analysis，  the “real－time”of biological process，  and         the critical  point  of  fermentation  tail  gas  analysis  curve  reflecting  the  change  information  of process state，  and the critical point obtained from tail gas analysis in fermentation engineering                 (guidance  of  speed  adjustment，   flow  feeding，   lactose  induction  and  treatment  of  abnormal         fermentation)  illustrated that only single channel detection can achieve real－time，  continuous and online detection，  and capture valuable “critical point”information．
Keywords：  fermentation；  tail gas analysis；  single channel；  detection

收稿日期：2022－09－01
基金項目：齊魯工業(yè)大學科教產(chǎn)融合試點工程基礎研究類基金資助項目 (2022PY067)；齊魯工業(yè)大學科教產(chǎn)重大創(chuàng)新專項(2022JBZ01－06)； 山東省重點研發(fā)計劃項目 (重大關鍵技術)(2016ZDJS07A20)
作者簡介：公維麗(1988 — )，女，山東臨沂人，副 研 究 員，研究方向為生物傳感器技術 、微生物發(fā)酵工程，E－mail：15264110812＠163．com。
通信作者：劉仲匯高級工程師，E－mail：sws2605384＠163．com。

發(fā)酵尾氣分析指在發(fā)酵過程中在線檢測尾氣中 的 CO2   和 O2   的體 積 分 數(shù)，計 算 呼 吸 代 謝 參 數(shù) CO2   釋放率(Carbon dioxide evolution rate，CER)、攝 氧 率(Oxygen uptake rate，OUR) 和 呼 吸 商 (Respira－ tory quotient，RQ)，得到細胞代謝信息，是發(fā)酵工程 的一種過程分析技術(Process analysis technology， PAT)。  無論 是 在 微 生 物 生 長 階 段，還 是 在 產(chǎn) 物 合成階段，CER 的變化都與菌 體 生 長 狀 態(tài) 、碳 源 的 消耗和供氧情 況 密 切 相 關 。  OUR 雖然取決于菌體濃度，但是也與發(fā)酵 液 的 營 養(yǎng) 成 分 、溶 氧 水 平 、菌 體 的比生長 速 率 以 及 碳 源 的 種 類 和 濃 度 等 因 素 有 關 。RQ的變化反 映 了 微 生 物 胞 內(nèi) 代 謝 的 變 化，揭 示 了發(fā)酵過程中微觀代謝途徑通量的變化，是 微 生 物 菌體生長 、能量代謝維持 、產(chǎn)物和副產(chǎn)物合成代謝共同作用的結果[1－7]  。利用這些參數(shù)及相關性分 析，可 以 更好地對發(fā)酵過程進行監(jiān)測 、分析，從而深入了解發(fā) 酵規(guī)律，優(yōu)化發(fā)酵 工 藝，控 制 發(fā) 酵 過 程，提 高 發(fā) 酵 產(chǎn) 率和產(chǎn)量，降低成本，加快新品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化 。
與溶解氧和 pH 檢 測 相 比，尾 氣 分 析 得 到 的 參 數(shù) CER，OUR 和 RQ 在 一定 程度上反映了發(fā)酵過 程的部分特質(zhì)，揭示了微生物的生理特性，具有生物 學意義 。尾氣分析時僅采集 發(fā)酵罐排出的尾氣，不 影響發(fā)酵罐 結 構，不 接 觸 發(fā) 酵 液，無 染 菌 風 險[8－10]， 更容易被業(yè)界接受，故成為現(xiàn)代發(fā)酵工程的重要分析 手段，已被應用于發(fā)酵、制藥、生化、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和食品 等領域 。  雖然該技術已在業(yè)內(nèi)得到應用，但是由于歷 史原因以及設備成本等因素的影響，對檢測設備是否 需要采用獨立的單 通 道，認 識 依 舊 模 糊 。  因 此，筆 者 從理論與實際應用兩方面對該問題加以分析探討 。
1    發(fā)酵尾氣分析應實時連續(xù)在線
在 發(fā) 酵 過 程 中，微 生 物 生 長 一 般 需 要 經(jīng) 歷 遲 緩 期 、對數(shù)生 長 期 、穩(wěn) 定 期 和 衰 亡 期[11]  。  常 規(guī) 的 液 態(tài) 好氧分批發(fā)酵周期一般為數(shù)小時至數(shù)天 。在看似較 長的發(fā)酵過程中，發(fā)酵狀態(tài)的轉變 往往發(fā)生在很短 的時間內(nèi)，某些代謝變化可能用時更短 。
張嗣良等 在《多 尺 度 微 生 物 過 程 優(yōu) 化》[12]  及 相 關論 文[13]   中 詳細闡述了生 物 過 程 的 “實 時 性 ”： 1)  從生物 過程發(fā)生的時 間以及 生物技術發(fā)展特點 來看，對于以活細 胞為主體的細胞 大規(guī)模培養(yǎng)的生 物反應過程，可粗分為在以基因水平的分子尺度 、代 謝調(diào)節(jié)的細胞尺度和工藝控制的反應器尺度上發(fā)生 的；2)  可將微 生 物 和 細 胞 在 酶 活 性 水 平 上(包 括 酶 的激活 、抑制，亞基的結合和解離以及共價修飾和降 解) 控制的時間常數(shù)描述在毫秒至秒的范圍內(nèi)，在基 因表達調(diào)控水平上(誘 導 、轉 錄的阻遏和去阻遏) 描 述至分鐘 ?？疾煳?生 物 和 細 胞 代 謝 調(diào) 節(jié)，在 以 秒 為 單位的時間尺 度 上 是 合 適 的 。   因 此，作 為 動 態(tài) 觀 測 記錄細胞代謝狀況 的 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 設 備，應 對 排 出 的尾氣進行實時連續(xù)在線檢測，只有這樣，才能準確 捕捉到發(fā)酵過程中代謝的改變 。

2    合理利用發(fā)酵過程中的臨界點
2．1    發(fā)酵過程中的臨界點
李強等[14] 在《微生物發(fā)酵 中 二 氧 化 碳 釋 放 速 率 變化規(guī)律》中，通過青霉素 、古龍酸 、二元酸和葡萄糖 酸 4 個體系的發(fā)酵實驗及動力學分析，對 CER 的變化規(guī)律進行了探 究，研 究 結 果 表 明：無 論 是 霉 菌 、酵 母菌 、細 菌 、單 液 相 體 系 、雙 液 相 體 系，還 是 純 種 發(fā) 酵 、混合菌發(fā) 酵，CER 的 變 化 都 與 體 系 狀 態(tài) 變 化 有 著密切聯(lián)系；CER 曲線上的轉 折 點 對 應 的 就 是 發(fā) 酵 狀態(tài)的轉變點 。   由該文獻的 CER 曲線可以發(fā)現(xiàn)：在 這些轉折點處曲線發(fā)生了方向性改變，即 由 升 轉 為 降，或者由降轉為 升，曲線出現(xiàn)明顯的峰或谷，發(fā) 酵 體系的狀態(tài)都發(fā)生了顯著改變 。
在發(fā)酵過程中還存在另一類極具價值 的 變 化 點，即發(fā)酵體系的狀態(tài)變化由緩慢到快速，或由快速 轉為緩慢的時間點，比如在微生物生長由遲緩期進 入對數(shù)生長期，由 對數(shù)生長期進入穩(wěn)定期以及由穩(wěn) 定期進入衰亡期的那些時間點上，都有可能出現(xiàn)該 情況 。在這類時間點上，雖然發(fā)酵體系的 CER 曲線 沒有發(fā)生方向性改 變(由 升到降或由降到升)，但 是 發(fā)生了變化速率的 顯 著 改 變，或者說發(fā)生了從一個 發(fā)酵階段轉變到另一個發(fā)酵階段 。這類變化點在發(fā) 酵過程中普遍存在，不僅有著明確的生物學意義，而 且具有非常重要的應用價值 。可將發(fā)酵過程中這類 變化速率顯著改變 的 點，以及發(fā)生方向性改變的轉 折點統(tǒng)稱為臨界變化點，簡稱“臨界點”，其特征是發(fā) 酵體系發(fā)生了從一個狀態(tài)到另一個狀態(tài)的改變，亦 或從一個階段到另一個階段的改變 。
應用發(fā)酵尾氣分析技術進行實時連續(xù) 在 線 監(jiān) 測，可方便 、直觀地獲得發(fā)酵過程中的臨界點 。這些 臨界點提供的豐富信息可以幫助人們辨識發(fā)酵過程 狀態(tài)，為 調(diào) 整 攪 拌 轉 速／通 氣 量 、流 加 補 料 、基 因 誘 導，以及異常 發(fā)酵處理等一系 列 工藝操 作提供 明確 指導，同時也為工藝放大提供對比數(shù)據(jù) 。充分重視和 利用這些臨界點信息對優(yōu)化發(fā)酵工藝具有重要意義 。
2．2    利用發(fā)酵過程臨界點指導操作
2．2．1    利用臨界點調(diào)整供氧
溶解氧是好氧發(fā)酵微生物生長及產(chǎn)物合成所必 需的 。在發(fā)酵過程 中，特 別是在高密度工程菌培養(yǎng) 中，溶解氧往往 成 為 限 制 性 因 素 。  如何適時調(diào)整攪 拌轉速和通氣量以達到***適溶解氧，是 發(fā) 酵 工 藝 的 關鍵點之一[15－17]  。  一般根據(jù)溶解 氧 DO、pH 及 鏡 檢 結果等進行調(diào)整，比較粗放，而利用尾氣分析曲線的 臨界點，則可以準確把握調(diào)整時機 。
在山東省科學 院 生 物 研 究 所 承 擔 的“植 酸 酶 工 程菌高密度發(fā)酵智能控制關鍵技術”(山東省重點研 發(fā)計劃項目 2016ZDJS07A20) 項 目 中，在 10L 實 驗 室發(fā)酵罐上，采用 FGA 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 儀，對 重 組 畢 赤酵母表達植酸酶過程進行實時在線檢測 。  發(fā)酵溫 度 30 ℃，初 始 發(fā) 酵 液 體 積 7L，通 氣 量 5L／min，攪拌轉速 200r／min 。  發(fā)酵 6h5min 時，CER 開 始 緩 慢上升；發(fā) 酵 25h26 min 時，CER 出 現(xiàn) 快 速 上 升， 曲線上形成明顯的 臨 界 點，預示發(fā) 酵進入對數(shù)生長 期，此時 立刻調(diào)整攪拌轉速至 400r／min；之 后 隨 著 CER 的上升，階段性小步調(diào)整攪拌轉速達 530r／min， 并保持至 發(fā) 酵 48h30  min，之 后調(diào)整攪拌轉速至 500r／min，直至 發(fā) 酵 結 束 。  該 發(fā) 酵 過 程 的 CER 變 化曲線如圖 1 所示 。在該過程中，發(fā) 酵 15h 時 進 行 甲醇誘導，誘 導 5h 后 開 啟 蛋 白 表 達，SDS－PAGE 檢 測植酸酶表達見文獻[18]，***終酶活達 3 000U／mL。

相關附件：論單通道檢測在發(fā)酵尾氣分析中的應用.pdf